為了展示Liberty Blue自動(dòng)化肽合成儀高效合成和官能化肽鏈的能力，我們合成了HIV-1抗體表位gp41_659-671（ELLELDKWASLWN）和Afamelanotide（Ac-SYSNleEHDFRWGKPV-NH₂）的分支型和內(nèi)酰胺環(huán)化變體。對(duì)于分支型變體，我們將H-Ala-OtBu與正交脫保護(hù)的Glu側(cè)鏈進(jìn)行偶聯(lián)。而對(duì)于環(huán)化變體，我們?cè)诰€性合成過(guò)程中引入了Lys(Alloc)，并在進(jìn)行內(nèi)酰胺環(huán)化之前，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行脫保護(hù)。

三、材料與方法

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：

用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗滌（4 x 4 mL）。接著，向反應(yīng)容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液（3 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.025 M Pd(PPh₃)₄在DCM中的溶液（1 mL），并在30°C下微波照射12分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽（4 x 4 mL）。重復(fù)此步驟兩次。完成后，進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作（4 mL），并用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為側(cè)鏈偶聯(lián)準(zhǔn)備肽。

側(cè)鏈偶聯(lián)：

向反應(yīng)容器中加入氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），并在90℃下微波照射4分鐘。然后排空反應(yīng)容器，并加入額外的氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL）。在90℃下再微波照射4分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：

同時(shí)Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脫保護(hù)：⁶

用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗滌（4 x 4 mL）。接著，向反應(yīng)容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液（3 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.025 M Pd(PPh₃)₄在DCM中的溶液（2 mL），并在30°C下微波照射12分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽（4 x 4 mL）。重復(fù)此步驟兩次。完成后，進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作（4 mL），并用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為通過(guò)內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化準(zhǔn)備肽。

通過(guò)內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化：

將0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液（8 mL）加入反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射10分鐘。然后排空反應(yīng)容器。此步驟重復(fù)兩次。完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：

Glu(OAllyl)脫保護(hù)：⁶

用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗滌（4 x 4 mL）。接著，向反應(yīng)容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液（2 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（8 mL），并在35℃下微波照射5分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽（4 x 4 mL）。重復(fù)此步驟一次。完成后，進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作（4 mL），并用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為側(cè)鏈偶聯(lián)準(zhǔn)備肽。

側(cè)鏈偶聯(lián)：

向反應(yīng)容器中加入氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射4分鐘。然后排空反應(yīng)容器，并加入額外的氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL）。溶液再次在90℃下微波照射4分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

N-末端乙酰化：⁷

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液（4 mL），在65℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并進(jìn)行洗滌操作（4 mL）。用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為肽的切割準(zhǔn)備。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：

同時(shí)進(jìn)行Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脫保護(hù)：⁶

用DMF（4 x 4 mL）洗滌肽，然后用DCM（4 x 4 mL）洗滌。接著，向反應(yīng)容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液（2 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.0312 M Pd(PPh₃)₄在DCM中的溶液（8 mL），并在35℃下微波照射5分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM（4 x 4 mL）洗滌肽。此步驟再重復(fù)一次。完成后，進(jìn)行兩次洗滌操作（4 mL），并用DMF（4 x 4 mL）洗滌肽，為通過(guò)內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化準(zhǔn)備肽。

通過(guò)內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化：

將0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液（8 mL）加入反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射10分鐘。然后排空反應(yīng)容器。此步驟再重復(fù)兩次。完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。

N-末端乙酰化：⁷

將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液（4 mL），在65℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并進(jìn)行洗滌操作（4 mL）。用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為肽的切割準(zhǔn)備。

四、肽分析

使用配備PDA檢測(cè)器的Waters Acqity UPLC系統(tǒng)對(duì)肽進(jìn)行分析，該系統(tǒng)配有一根Acquity UPLC BEH C8色譜柱（1.7微米，2.1 x 100毫米）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。峰分析在Waters MassLynx軟件上完成。分離通過(guò)梯度洗脫進(jìn)行，流動(dòng)相為0.1% TFA在(i) H₂O和(ii) MeCN中。

五、結(jié)果

在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過(guò)微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的Glu分支型HIV-1抗體表位gp41_659–671的目標(biāo)肽純度為82%（圖2）。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過(guò)微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的內(nèi)酰胺環(huán)化型HIV-1抗體表位gp41_659–671的目標(biāo)肽純度為87%（圖3）。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過(guò)微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的Glu分支型阿法美拉肽的目標(biāo)肽純度為85%（圖4）。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過(guò)微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的內(nèi)酰胺環(huán)化型阿法美拉肽的目標(biāo)肽純度為80%（圖5）。